Kvasinka Candida utilis bola prvýkrát popísaná v roku 1926 a spočiatku bola využívaná ako potravinárska kvasinka na výrobu jednobunkových proteínov z lacných substrátov pochádzajúcich z biomasy [1, 2]. Už viac ako šesť desaťročí sa zaraďuje medzi priemyselne dôležité kvasinky a v posledných rokoch boli vyvinuté mnohé nástroje pre expresiu heterológnych génov pre C. utilis [1, 3]. Úrad pre kontrolu potravín a liečiv (FDA) kvasinku C. utilis všeobecne považuje za bezpečnú (GRAS) [4].

V našej práci sme sa zamerali na maltázový promótor. Tento promótor sa nachádza v rámci MAL lokusu a je zodpovedný za maltózový metabolizmus v druhoch Saccharomyces, ale aj u kvasinky C. utilis. Každý MAL lokus je komplexom, ktorý pozostáva z troch génov: gén pre transkripčný aktivátor, gén pre maltózo-permeázu a gén pre maltázu. Všetky gény sú zapojené do metabolizmu maltózy a kmeň, v ktorom je prítomný aspoň jeden MAL lokus je schopný metabolizmu maltózy [5].

Tento promótor sa snažíme upraviť, aby mal čo najnižšiu katabolickú represiu a zároveň, aby zostala zachovaná jeho citlivosť na maltózu, ktorá je jeho prirodzeným induktorom. Vytvorili sme plazmidy pMZ131 a plazmid pML2. Plazmid pMZ131 nesie promótor, ktorý obsahuje počet guanínov, ktorý je totožný s divým promótorom P_GLC a to z dôvodu objavenia delécie nukleotidu v promótore plazmidu pMZ13. Plazmid pMZ13 bol v predošlej práci pripravený cielenou mutagenézou väzobných miest pre Mig1 represorový proteín, ktorý je zodpovedný za katabolickú represiu v prítomnosti glukózy. Plazmid pMZ131 sa budeme snažiť integrovať do chromozómu kvasinky C. utilis cez oblasť HIS3 génu a sledovať impakt mutácií v oboch plazmidoch na promótor P_GLC. Budeme porovnávať ako mutácia v oblasti promótora v plazmide pMZ13 bude pôsobiť na účinnosť promótora v porovnaní s plazmidom pMZ131. Plazmid pML2 nesie gén pre β-galaktozidázu, ktorý je radený za promótorom pochádzajúceho z plazmidu pMZ13. Prostredníctvom tohto plazmidu budeme môcť stanoviť aktivitu promótora spektrofotometricky s použitím chromogénneho substrátu po transformácii kvasinky C. utilis plazmidmi pMZ11, pMZ12, pMZ13 a pMZ131, ktoré boli vytvorené prostredníctvom cielenej mutagenézy.

Tento projekt bol pripravený na základe projektu „Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov“ (BIOREKPROT - ITMS: 26240220048) financovaný zo zdrojov ERDF a vďaka projektu APVV-17-0149 a PP-COVID-20-0019.

[1] Buerth C., Tielker D., Ernst J. F. (2016) Appl. Microbiol. Biotechnol. 100(16), p. 6981.
[2] Buerth C., Heilmann C., Klis F. M., et al. (2011) Microbiol. 157(9), p. 2493.
[3] Boze H., Moulin G., Galzy P. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12(1/2), p. 65.
[4] U.S. Food & Drug Administration [Citované: 20. marec 2021].
[5] Needleman R. (1991) Mol. Microbiol. 5(9), p. 2079.
[6] Pavlíková B. (2018) Mutagenéza regulačných oblastí maltázového génu kvasinky Candida utilis. (Diplomová práca) Univerzita Komenského v Bratislave.