Mikroglie predstavujú hlavné imunokompetentné bunky CNS. Sú prvou odpoveďou na infekciu alebo poškodenie tkaniva v CNS a iniciujú zápalovú odpoveď. So stúpajúcim vekom podliehajú zmenám nielen ich funkcie ale aj fenotyp^1,2. Po opakovaných aktiváciách sa mikroglie nedokážu vrátiť na svoju bazálnu úroveň a stávajú sa hypersenzitizovanými. Na druhej strane, v starnúcom mozgu sa môžu vyskytovať v senescentnej forme (typická je replikačná senescencia, dystrofia, veľké množstvo vakuol)³. Najväčším zmenám podliehajú mitochondrie (stúpajúca produkcia RFK, dysfunkcie respiračného reťazca) a lyzozómy, kde sa akumuluje lipofuscín - nedegradovateľný polymérny fluorescenčný materiál⁴. Oba fenotypy - hypersenzitívny aj senescentný sa môžu vyskytovať za rozličných podmienok počas starnutia a oba zvyšujú riziko vzniku neurodegeneratívnych ochorení.

Vytvorenie podpornej gliovej vrstvy predstavuje primárny krok v izolačných postupoch zameraných na získanie gliových sub-populácií ako sú mikroglie ale aj oligodendrocyty. Kritickými faktormi môže byť účinnosť disociácie tkaniva, vitalita získanej bunkovej suspenzie, eliminácia myelínovej debris, ale aj vek zvieraťa. Cieľom našej štúdie bolo charakterizovať podpornú gliovú vrstvu založenú z cerebrálneho tkaniva rôzne starých potkanov kmeňa Wistar (2 a 22 mesačné jedince) v skorých štádiách jej stabilizácie.

Rozdiely v zložení podpornej gliovej vrstvy v oboch typoch kultúr sme hodnotili z hľadiska ich morfológie na štvrtý deň in vitro (4DIV). Väčšie zastúpenie buniek s kontrastnými vakuolami a typickou ramifikáciou poukazovalo na prítomnosť fagocytujúcich mikroglií. V kultúrach založených z mladých jedincov bolo evidentné zastúpenie aj iných typov buniek.

Po ďalších 2 DIV sme z podpornej vrstvy založili sekundárnu kultúru, ktorú sme charakterizovali pomocou imunocytochémie. Zaujímavosťou bolo zistenie, že v prípade 22 mesačných jedincov sme získali pomerne homogénnu populáciu buniek so zvýšenou autofluorescenciou a fagocytárnou morfológiou. Kultúra bola pozitívna na izolektín B₄, špecifický marker pre mikroglie a vo zvýšenej miere akumulovala neutrálnu červenú (typická vlastnosť fagocytov). V mladých kultúrach bolo evidentné väčšie zastúpenie buniek polygonálnej morfológie len nepatrne akumulujúcich toto farbivo.  Predpokladáme, že by mohlo ísť o fibroblasty alebo endotelové bunky, pretože neboli pozitívne ani na jeden zo sledovaných markerov (CD45 - marker exprimovaný makrofágmi, GFAP - marker pre astrocyty, Gal - galaktocerebrozid, marker pre oligodendrocyty). Spektrofluorimetrickou analýzou sme v starých bunkách kvantitatívne dokázali vyšší signál autofluorescencie a tiež zníženie mitochondriálneho membránového potenciálu, čo potvrdzuje zníženie proteolytickej kapacity a mitochondriálnych funkcií spojené so starnutím.

Z výsledkov vyplýva, že gliovú podpornú vrstvu pripravenú zo starých potkanov nemožno, vzhľadom k chýbajúcim komponentom poskytujúcim trofickú podporu a funkčným zmenám v dôsledku starnutia, použiť k dlhodobým kultiváciám s následnou izoláciou sub-populácií. Vzhľadom k jej homogénnosti však môže predstavovať vhodný model pre krátkodobé štúdie starnutia mikroglií a možnosti jeho farmakologického ovplyvnenia.

Práca bola finančne podporená grantom VEGA 2/0031/12.

1. Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D. & Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front. Cell. Neurosci. 7, 45 (2013).
2. Norden, D. M. & Godbout, J. P. Review: microglia of the aged brain: primed to be activated and resistant to regulation. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 39, 19–34 (2013).
3. Olah, M., Biber, K., Vinet, J. & Boddeke, H. W. G. M. Microglia phenotype diversity. CNS Neurol. Disord. Drug Targets 10, 108–118 (2011).
4. Wong, W. T. Microglial aging in the healthy CNS: phenotypes, drivers, and rejuvenation. Front. Cell. Neurosci. 7, 22 (2013).