Produkcia rekombinantných proteínov vo forme fúznych proteínov je jedným zo spôsobov získavania aktívnych látok využívaných vo farmaceutickom priemysle. V niektorých prípadoch môže byť prítomnosť fúznej značky nežiaduca alebo predstavovať problém pre budúce využitie rekombinantného proteínu na klinické účely [1]. Enterokináza (EK) je serínová proteáza, ktora má schopnosť štiepiť presne na N-konci substrátu v sekvencii (Asp)₄Lys a nezanecháva aminokyselinové zvyšky. Preto sa tomuto vysoko špecifickému heterodimérnemu enzýmu venuje bližšia pozornosť v súvislosti s odstraňovaním fúznych partnerov a iných nežiaducich látok obsahujúcich túto rozoznávaciu sekvenciu [2].

Našou úlohou je štúdium produkcie a následna efektívna purifikácia enzýmu EK, pri čom cieľom práce je dosiahnúť aktívnejšiu formu EK ako je komerčne dostupná na trhu a to tým, že sme pripravili viacero mutovaných foriem (MutEK) [3].

Na analýzu vzoriek odoberaných počas purifikácie sme využívali metódu SDS-PAGE. Aktivitu nami vyprodukovanej enterokinázy predstavuje pomer poštiepeného tioredoxínu (Trx) ku Trx-DCD (tioredoxín-dermicidín). Na základe percenta štiepenia substrátu Trx-DCD pomocou  EK max sme si prepočítali počet jednotiek nami vyprodukovanej EK. Po fermentácii a úprave prostredia sa nachádzalo v médiu 475 U/ml a teda spolu 342 158 U. Po poslednom kole purifikácie špecifická aktivita bola 567 U/ml a celková 56 693 U. Problémy so stratou  aktivity enzýmu  počas purifikačných krokov sú zrejme zapríčinené v dôsledku proteolytickej degradácie. Hodnota michaelisovej konštanty bola 0,415 mM, čo je omnoho menej ako v prípade komerčne dostupnej EK. V hodnote Turnover number mala nami vyprodukovaná EK nižšie hodnoty. Priemerna hodnota 15,095 mM^-1.sek^-1 je o 46% nižšia. V konečnom dôsledku je nami vyprodukovaná EK aktívnejšia a teda enzým premieňa substrát na produkt efektívnejšie.

Práca vychádza z projektu: Univerzitný vedecký park univerzity Komenského v Bratislave. ITMS: 26240220086 , Vybudovanie Kompetenčného centra pre výskum a vývoj v oblasti molekulárnej medicíny. ITMS: 26240220071.

[1] Terpe, K. (2006) Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol, 72(2), p 211-222.
[2] Niu Li-Xi , Li Jia-Yue , Xue-Xue Ji, Bin-Sheng Yang (2004), High-level secretory production of recombinant bovine enterokinase light chain by Pichia pastoris, J BIOTECHNOL, 108(2), p 185-192.
[3] Jiríčková K. (2015),  Produkcia mutovanej formy ľahkého reťazca ľudskej enterokinázy v Pichia pastoris (Dizertačná práca), Univerzita Komenského v Bratislave.