Sekrece proteinů do média je u většiny eukaryotických organismů řízena pomocí terminální signální sekvence. Bez tohoto přídavku jsou proteiny sekretovány nesprávně, ba mnohdy v nerozpustné formě. Proto výběr vhodné signální sekvence hrá klíčovou roli při návrhu konstruktů jejíchž výsledkem je funkční heterologický protein sekretovaný do kultivačního média v aktivní solubilní formě. Zároveň sekrece rekombinantních proteinů je ekonomický méně náročnější, neboť purifikační kroky jsou zjednodušeny.

Co se týká výběru produkčního kmene, zaměrili jsme se na kvasinku Candida utilis, která je nepatogenním mikroorganismem se schopností utilizovat řadu finančně nenáročných dusíkatých a uhlíkových zdrojů  [1]. Zároveň znalost genomové sekvence a zjištění že narozdíl od jiných kvasinek nepatří do CUG rodiny a tudíž překládá tento kodon podle klasického genetického kódu ji předurčuje za vhodný heterologický systém. Mezi další výhody tohoto organismu je skutečnost, že oproti jiným kvasinkovým druhům nebyly v C. utilis doposud analyzovány extracelulární proteázy, které by mohly znižovat výtažky rekombinantních proteinů [2,3].

Cílem naší studie je zabudování genu kódující lidskou enterokinázu do genomu C. utilis takovým způsobem, aby její terminální konec byl situovaný do lumenu ER. Pro ukotvení enterokinázového genu jsme na jeho C- terminální konec připojili transmembránovou doménu. Lehký řetězec enterokinázy rozpoznává sekvenci aminokyselin DDDDK a štěpí preferenčně za poslední aminokyselinou. Díky této vlastnosti se používá na odstranění afinitní značky. V naší práci budeme proteolytickou aktivitu tohoto proteinu detekovat pomocí konstruktu obsahující maltázový gen s daným rozponávajícím místem. Správná inkorporace enterokinázy a její aktivita bude detekována sníženou aktivitou maltázového genu. Enterokináza bude exprimována pod slabým konstitutivním promotorem, aby se zabránilo nespecifické aktivitě nadměrně exprimované enterokinázy.

Tato práce byla připravena na základě podpory projektu APVV-0119-12.

[1] Bekatorou A., Psarianos C., a Koutinas A. A. (2006). Food Technology and Biotechnology. 44: 407-415.
[2] Tomita Y., Ikeo K., Tamakawa H., et al. (2012). PloS one 7: e37226.
[3] Buerth, C., Heilmann, C. J., Klis., et al. (2011). Microbiology 157: 2493-2503.