Izolácia a kvantifikácia exozómov z kondiciovaného média mezenchýmových kmeňových buniek z chorionu

Mezenchýmové kmeňové bunky (MKB) sú stromálne bunky schopné sebaobnovy so schopnosťou diferencovať sa do viacerých bunkových línií (napr. tuk, chrupka, kosť). Dajú sa izolovať z rôznych typov tkanív ako sú kostná dreň, tukové tkanivo, plodový obal, pupočník, ale aj menštruačná krv ^[1]. O exozómoch ako o membránových časticiach vnútrobunkového pôvodu sa dlho predpokladalo, že sú iba odpadovými produktami metabolizmu buniek. Tieto extracelulárne vezikuly dosahujúce veľkosti približne 50-150 nm sú zodpovedné za medzibunkovú komunikáciu, signalizáciu a odstraňovanie rôznorodej škály nežiadúcich komponentov z bunky. Ich molekulárny obsah väčšinou kopíruje zloženie ich materskej bunky. Exozómy obsahujú a  zabezpečujú prenos rôznych proteínov, RNA (hlavne miRNA), lipidov a metabolitov ^[2].

V našej štúdii boli MKB izolované z chorionu enzymaticky a kultivované do tretej pasáže. Kondiciované médium z MKB bez prítomnosti séra (po dobu 24, resp. 48 hod.), sme zakoncentrovali veľkokapacitnou filtračnou aparatúrou. Exozómy sme následne izolovali precipitačnou metódou (Total Exosome Isolation Reagent, Invitrogen). Precipitácia je v porovnaní s ostatnými metódami na izoláciu exozómov (ultracentrifugácia, chromatografia na základe veľkosti častíc, imunomagnetická izolácia a i.) časovo nenáročná a efektívna metóda na získanie dostatočného množstva exozómov. Precipitáciou sme získali exozómy, ktoré sme následne charakterizovali a kvantifikovali pomocou prietokovej cytometrie a ELISA metódou.

Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci operačného programu Integrovaná infraštruktúra pre projekt Otvorená vedecká komunita pre moderný interdisciplinárny výskum v medicíne (OPENMED), kód ITMS2014+: 313011V455, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja a vďaka Slovenskej grantovej agentúre VEGA 1/0229/20 a APVV-17-0118.

[1] Ding, D.C.; Shyu, W.C.; & Lin, S.Z. (2011). Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation, 5-14.
[2] Patel, G.K.; Khan, M.A.; Zubair, H. et al. (2019). Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep 9, 5335.