Príprava rekombinantného plazmidu s inzertom šaperón-like génu z Cronobacter sakazakii pod indukovateľným lac wt promótorom

Molekulárne šaperóny predstavujú špecializované proteíny, ktoré participujú pri správnom skladaní novovznikajúcich polypeptidov  („de novo folding“), v „refoldingu“ denaturovaných proteínov, a taktiež v ich proteolytickej degradácii [1]. Zistilo sa, že kmene rodu Cronobacter vlastnia genomický ostrov termotolerancie s veľkosťou 15kbp, v ktorom sa identifikovali viaceré gény stresovej odpovede, vrátane šaperón-like sekvencií, ako napr. gén orfD [2]. Pri heterológnej expresii rekombinantných proteínov vo vyššej koncentrácii býva jedným z negatívnych javov tvorba agregátov, tzv. inklúznych teliesok. Renaturácia takýchto agregátov prebieha v bunke E. coli s nízkou frekvenciou, v dôsledku čoho vzniká biologicky neaktívny proteín [3].

Hlavným cieľom našej práce je konštrukcia rekombinantného plazmidu s inzertom génu orfD pod indukovateľným lac wt promótorom.

V našej práci sme úspešne amplifikovali DNA fragmenty s orfD a orfC+D sekvenciami z kmeňa C. sakazakii LMG 5740 pomocou gradientovej PCR. V získaných transformantoch po ligácii vektora s oboma DNA sekvenciami sme pri skríningu zatiaľ nepotvrdili konštrukciu plánovaných rekombinantných plazmidov. V ďalšej práci budeme pokračovať v skríningu rekombinantného plazmidu s vloženým génom orfD, resp. orfC+D, kódujúcim šaperón pod kontrolou indukovateľného lac promótora. Následne využijeme konštrukty pri funkčných štúdiách.

Táto publikácia vznikla vďaka podpore projektov: „Univerzitný vedecký park Univerzity Komenského v Bratislave – 2. Fáza“ (ITMS 2014+ 313021D075), „Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov“ (BIOREKPROT – ITMS: 26240220048) a „Rozvoj centra excelentnosti pre využitie informačných biomakromolekúl na zlepšenie kvality života“ (BIOMAKRO2 - ITMS 26240120027), financovaných zo zdrojov ERDF, financovaných zo zdrojov ERDF.

[1] Hartl F. U. (1996) Nature 381, p. 571.
[2] Orieskova M., Kajsik M., Szemes T. et al. (2016) Antonie van Leeuwenhoek 109: p. 405.
[3] Ellis R. J., Minton A. P. (2006) Biol. Chem. 387, p. 48.