Fosforylácia je postranslačná modifikácia modulujúca funkciu proteínu, ktorá je nevyhnutná pre bunkovú signalizáciu, proliferáciu, diferenciáciu a rast. Ide o dynamický proces, ktorého deregulácia spôsobuje množstvo chorobných procesov, vrátane rakoviny (1). Technológie založené na kvapalinovej chromatografii, ktorá je spojená s hmotnostnou spektrometriou (MS) predstavujú efektívny nástroj na identifikáciu proteínov a ich postranslačných modifikácií. Pretože fosforylované  peptidy sa nachádzajú v komplexných vzorkách v oveľa menšom zastúpení, v porovnaní s ich nemodifikovanými formami, je nutné, aby pracovný postup obsahoval krok zabezpečujúci obohatenie fosforylovaných peptidov (2). Nevyhnutnou prípravy vzoriek je aj frakcionácia, ktorá významne znižuje komplexnosť vzoriek a tým zvyšuje množstvo identifikovaných fosforylačných miest. 

Nedávno optimalizovaný pracovný postup z nášho laboratória zahŕňa extrakciu proteínov, enzymatické štiepenie proteínov na peptidy a extrakciu na reverznej fáze. Nasledujú kroky typické pre prípravu fosfoproteomických vzoriek, konkrétne obohatenie fosfopeptidov pomocou afinitnej chromatografie s imobilizovaným kovom (IMAC) a frakcionácia pomocou silnej anión-výmennej (SAX) a poréznej grafitovej (PGC) chromatografie. Na MS analýzu sa používa kvapalinová chromatografia nanoflow Ultimate HPLC spojená s hmotnostným spektrometrom Orbitrap. Na spracovanie a bioinformatickú analýzu MS dát sa využívajú softvérové ​​nástroje MaxQuant a Perseus (3).

Takýmto spôsobom boli analyzované dve skupiny vzoriek, ktoré sa líšili použitou frakcionačnou technikou, PGC resp. SAX. Rozdiely medzi vzorkami boli skúmané na úrovní proteínových skupín, ako aj fosforylačných miest. Z našich zistení vyplýva, že pomocou rôznych techník sú vzorky obohacované o rozličné fosfopeptidy. Preto kombináciou rôznych frakcionačných metód je možné dosiahnuť významné zvýšenie množstva identifikovaných fosforylačných miest. Použitím vyššie uvedeného spôsobu prípravy vzoriek a následnej analýzy pomocou hmotnostnej spektrometrie sme  boli schopní identifikovať 1274 nových, doposiaľ neanotovaných fosforylačných miest, ktoré môžu byť prínosné pre pochopenie regulácie bunkových procesov.

1. (1) Zhang, J., Yang, P.L., and Gray, N.S. (2009). Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat. Rev. Cancer 9, 28–39.
   (2) Ruprecht, B.; Koch, H.; Medard, G.; Mundt, M.; Kuster, B.; Lemeer, S. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Mol. Cell. Prot. 2015, 14, 205–215.
   (3) Sivakova, B., Jurcik, J., Lukacova, V., Selicky, T., Cipakova, I., Barath, P., & Cipak, L. (2021). Label-Free Quantitative Phosphoproteomics of the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe Using Strong Anion Exchange-and Porous Graphitic Carbon-Based Fractionation Strategies. International journal of molecular sciences, 22(4), 1747.