Na základe sekvencií moderných enzýmov bol in silico navrhnutý spoločný predok haloalkán dehalogenázy (HLD, EC 3.8.1.5)¹ a Renilla luciferín 2-monooxygenázy (RLuc, EC 1.13.12.5)². Tento ancestrálny proteín nazvaný AncHLD-RLuc vykazuje obe aktivity, dehalogenázovú (10x nižšiu ako HLD LinB) aj luciferázovú (10000x nižšiu ako RLuc).

Porovnanie kryštálových štruktúr ancestrálneho s modernými enzýmami ukázalo ich vysokú štruktúrnu podobnosť. Hlavný rozdiel je vidieť v usporiadaní sekundárnych štruktúr čiapky a v konformácii slučky, ktorá spája hlavnú doménu a čiapku. Flexibilita tohoto regiónu pravdepodobne prispieva k väzbe luciferínu kolentrazínu.

Náhodné inzercie a delécie boli vnesené do AncHLD-RLuc aby sa zistilo, či zmena v kostre proteínu vedie k zmene v jeho aktivite a špecificite. Vytvorené knižnice boli testované na dehalogenázovú a luciferázovú aktivitu a najaktívnejšie hity boli osekvenované a detailne ocharakterizované. Zaujímavé je, že varianty vykazujúce až 60x vyššiu luciferázovú aktivitu niesli zmeny práve v oblastiach, kde sa štruktúra predka najviac odlišuje od enzýmu RLuc.

1. 1. Koudelakova T, Bidmanova S, Dvorak P, Pavelka A, Chaloupkova R, Prokop Z, Damborsky J. Biotechnol. J. 2013, 8 (1), 32.
   2. Lorenz WW, McCann RO, Longiaru M, Cormier M.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991, 88 (10), 4438.