Název arbovirus je akronymem anglického „ARthropode BOrne VIRus“ – členovci přenášený virus. Po celém světě je známo více než 500 arbovirů, které většinou způsobují zoonózy [1]. Některé infikují člověka pouze příležitostně, nebo způsobují mírné onemocnění, zatímco jiné mají velký medicínský význam a způsobují rozsáhlé epidemie se závažnou mortalitou. Mezi nejvýznamnější zástupce arbovirů ve střední Evropě patří viry z čeledě Flaviviridae, avšak v Evropě se zaznamenal výskyt i dalších, mnohdy opomíjených arbovirů. K vykonávání aktivního monitoringu prevalence arbovirů je nezbytné zpracování velkého množství vzorek, obzvláště vektorů a rezervoárových druhů. Reverse Line Blot (RLB) je hybridizační metoda, která umožňuje detekovat v relativně krátkém časovém úseku poměrně velké množství vzorků najednou na přítomnost hned několika virů, respektive jejich genů. Po reverzní transkripci virové RNA následuje rodově (Flavivirus) specifická PCR s biotinylovanými primery, kterými jsme schopní detekovat a amplifikovat fragment genu NS5, který je nejkonzervativnější pro námi hledané flaviviry. V naši práci jsme se zaměřili na flaviviry vyskytující se ve střední Evropě, a to virus klíšťové encefalitidy (Tick-borne encefalitis virus; TBEV), západonilské horečky (West Nile virus; WNV) a Usutu virus (USUV). Na nitrocelulózové membráně jsou v liniích imobilizované druhově specifické DNA sondy. Kolmo na ně se do linií přidají denaturované PCR produkty značené biotinem. V případě, že PCR produkt obsahuje sekvenci komplementární k námi navržené sondě, dojde k hybridizaci. Potom se přidá streptavidín značený peroxidázou, který má silnou afinitu k biotinu navázanému na PCR produktech. Reakce se vizualizuje pomocí chemiluminiscence a světelná emise je zaznamenána na fotocitlivý RTG film [2]. V rámci fragmentu genu NS5, který je pro námi hledané flaviviry silně konzervativní, se nám podařilo navrhnout 3 specifické sondy umožňující detekci TBEV, WNV a USUV.  Citlivost PCR reakce a metody reverzní hybridizace na základě NS5 genu je pro WNV a USUV 1×10³ ng/µl a pro TBEV 1×10⁴ ng/µl. Dalším krokem je stanovení senzitivity metody vyjádřené v TCID₅₀, anebo PFU počínající od izolace RNA. Kromě toho, další druhově specifické sondy nacházející se v jiném genu jsou již navrženy a budou otestovány. Našim cílem je taktéž navrhnout sondy, za pomocí kterých bychom byli schopni odlišit jednotlivé podtypy, resp. linie.

1. [1] Hubálek, Z., Rudolf, I., Nowotny, N. (2014). Chapter Five - Arboviruses Pathogenic for Domestic and Wild Animals, In: Karl Maramorosch and Frederick A. Murphy, Editor(s), Advances in Virus Research, Academic Press (89), Pages 201-275, ISSN 0065-3527, ISBN 9780128001721, http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-800172-1.00005-7.
   [2] O'Sullivan, M.V.N., Zhou, F., Sintchenko, V., Kong, F., Gilbert, G.L. (2011). Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB).J. Vis. Exp. (54), e2781, doi:10.3791/2781