Enzymatické štiepenie špecifickou endopeptidázou poskytuje najefektívnejší spôsob odstránenia afinitnej značky a nosných proteínov z cieľových rekombinantných proteínov [1]. Enterokináza (EC 3.4.21.9), je transmembránová serínová proteáza, ktorá reguluje štiepiacu kaskádu pankreatických enzýmov v dvanástniku u chordát a je jedným z najčastejšie používaných enzýmov pre tieto účely. Ako fyziologický aktivátor rozpoznáva sekvenciu DDDDK ↓ X trypsinogénu s vysokou špecificitou a premieňa ho na aktívnu formu trypsín odstránením N-terminálej peptidovej sekvencie nasledujúcej za (Asp)₄-Lys, bez akýchkoľvek ďalších nežiadúcich aminokyselín [2]. Katalytická podjednotka poskytuje vyššiu účinnosť čistého odštiepenia za rozpoznávacou sekvenciou samotného cieľového proteínu od fúzneho partnera oproti natívnemu enzýmu [3]. Rovnako si zachováva svoju aktivitu po heterologickej expresii a purifikácii v Escherichia coli a Pichia pastoris.

Podadrilo sa identifikovať a charakterizovať rôzne silné indukovateľné a konštitutívne promótory P. pastoris ako skvelé nástroje na produkciu rekombinantných proteínov. V posledných rokoch konštitutívny promótor glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázového génu, PGAP, sa dostal do popredia ako alternatívny promótor pre konštitutívnu expresiu rekombinantných proteínov, najmä vďaka tomu, že neinhibuje rast a nie je toxický pre bunky [4]. Niektoré porovnávacie štúdie uvádzajú, že heterologická expresia proteínov pod kontrolou PGAP promótora je účinnejšia ako PAOX1, [5], a najmä pre rhEKL a to až 5,6-násobne vyššiu produktivita rhEKL v porovnaní s PAOX1.

Počas fed-batch fermentácie sme zistili, že špecifická rýchlosť rastu má zásadný vplyv na úroveň expresie. Špecifická rýchlosť rastu 0.15 h^-1 počas kultivácie mala za následok negatívny vplyv na produkciu enterokinázy, nakoľko špecifická aktivita média bola veľmi nízka a dosiahla hodnoty pod úrovňou 1 U.ml^-1. Ďalšia stratégia, ktorou sme chceli dosiahnuť vyšší výťažok rekombinantného proteínu, bolo zníženie špecifickej rýchlosti rastu, výsladky však korelovali s predchádzujúcimi experimentmi.

Práve tretí, neštandardný spôsob fed-batch fermentácie, sa nám ukázal ako najefektívnejší. Významné zvýšenie aktivity v médiu sme pozorovali až po páde špecifickej rýchlosti rastu takmer na nulu, keď bunky dosiahli stacionárnej fáze podobnú fázu alebo lepšie povedané, keď rast buniek bol veľmi pomalý v dôsledku vysokej hustoty buniek, akumulácii inhibujúcich metabolitov alebo nedostatku niektorých živín. Enzýmová aktivita na konci tejto stratégie fermentácie bola viac ako 1500-násobne vyššia oproti ostatným stratégiám.

Príspevok je výsledkom podpory slovenskej agentúry pre výskum a vývoj APVV- 0119-12 .

[1] Light, A., Janska h., (1989) Trends. Biochem. Sci. 14(3), p.110.
[2] Holzinger, A., et al. (2002) Am. J. Hum. Genet. 70(1), p. 20.
[3] Kitamoto, Y., et al. (1995) Biochemistry-US. 14(34), p. 4562.
[4] Gasparian, M. E., et al (2006) Biochemistry-US. 71(2), p. 113.
[5] Lu, D., et al (1999) J. Mol. Biol. 292(2), p. 29.