Trombín patrí medzi serínové proteázy a zohráva nezastupiteľnú úlohu v kaskáde krvnej koagulácie.  Vystupujúci ako multifunkčný enzým, trombín má niekoľko prekurzorov, medzi ktoré patrí aj pretrombín-1, ktorý sa od protrombínu (dlhší prekurzor) líši absenciou 155 aminokyselinových zvyškov na N-terminálnom konci a pozostáva z polypeptidového reťazca zloženého z fragmentu 2, a A a B trombínového reťazca [1,2,3]. Potenciálom farmaceutického využitia trombínu v klinickej praxi je napríklad príprava lokálneho hemostatika s obsahom trombínu a jeho využitie v rôznych oblastiach chirurgie [4].

V tejto práci sme sa zamerali na produkciu rekombinantného pretrombínu-1 ako jedného z  prekurzorov trombínu v hostiteľských systémoch Escherichia coli. Práve bakteriálny systém E. coli je pomerne často využívaný na produkciu rekombinantných proteínov, nakoľko dokáže v  podmienkach nenáročných na zloženie kultivačného média produkovať veľké množstvo proteínu v  priebehu niekoľkých hodín [5]. Exprimovaný proteín, v našom prípade pretrombín-1, je v tomto prokaryotickom systéme exprimovaný vo veľkom množstve. Ak je expresia príliš rýchla alebo dochádza k nesprávnemu foldingu proteínu, polypeptidové reťazce sa hromadia v cytoplazme a tvoria tzv. inklúzne telieska. Inklúzne telieska tak predstavujú nesolubilné zhluky rekombinantného proteínu. Obrovskou výhodou tohto systému je ochrana proteínu pred bunkovými proteázami a jeho vysoká koncentrácia a čistota v inklúznych telieskach [6,7]. Jednu z nevýhod môže predstavovať isté percento straty pri spätnej revitalizácií cieľového proteínu. Pomocou chaotropných činidiel alebo silných aniónových detergentov je možné rekombinantný proteín solubilizovať z inklúznych teliesok a vhodným pufrom ho opätovne renaturovať [8]. Náš experiment bol zameraný na prípravu konštruktu obsahujúceho cieľový gén pre pretrombín-1 so sekvenciou pre His-tag na N-konci proteínu. V nasledujúcom kroku boli týmto expresným vektorom transformované bunky E. coli BL21ai a optimalizované podmienky expresie. Cieľový proteín sme v najväčšej miere získali v podobe inklúznych teliesok, čim sme potvrdili predchádzajúce experimenty. Nasledovne prebehla izolácia a solubilizácia rekombinantného proteínu z inklúznych teliesok, načo nadviazala purifikácia metódou IMAC na niklovej matrici [9,10].

Táto práca vychádza z projektu "Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov“ (BIOREKPROT), na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja (ITMS:26240220048).

[1] Di Cera E. (2008) Mol. Aspects Med. 29, p. 203.
[2] Michelson A. D. (2007) Platelets, Thrombin Receptors p. 179.
[3] So I. S., et al. (1992) Korean Biochem. J. 25, p. 60.
[4] Kessler C. M., Ortel T. L. (2009) Thromb. Haemost. 101, p. 15
[5] Lew W. K., Weaver F. A. (2008) Biologics: Targets & Therapy 2(4), p. 593
[6] Choi E. H., et al. (1989) Korean Biochem. J. 22, p. 154.
[7] Soejima K., et al. (2001) J. Biochem. 130, p. 269.
[8] Bonniec B. F. L., Guinto E. R., Esmon C. T. (1992) J. Biol. Chem. 267(27), p. 19341.
[9] Baneyx F. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, p. 411.
[10] Ferrer-Miralles N., et al. (2009) Microbial Cell factories 8, p. 17.